人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化

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摘要：0 引言 Introduction 骨关节炎是一种全球范围内常见的退行性、致残性疾病，其主要病理改变是关节软骨的退变和损伤[1]。由于缺乏神经分布和血管供应，关节软骨一旦损伤将很难自我修复

0 引言 Introduction

骨关节炎是一种全球范围内常见的退行性、致残性疾病，其主要病理改变是关节软骨的退变和损伤[1]。由于缺乏神经分布和血管供应，关节软骨一旦损伤将很难自我修复[2-3]，因此关节软骨损伤修复一直是关节外科研究的热点与难点[4]。间充质干细胞是来源于中胚层的多能干细胞，在一定条件下可以定向分化成软骨细胞，并在关节软骨修复中发挥重要作用[5]。

人髌下脂肪垫干细胞(infrapatellar fat pad derived stem cells，IPFP-ASCs)相对于骨髓、滑膜、皮下脂肪等其他来源干细胞更易获得，其通常来源于膝关节置换术或膝关节镜术中切除废弃的髌下脂肪垫，因此避免了为获取干细胞进行取材而对患者身体造成的额外损伤[6]。IPFP-ASCs 还具有取材容易、获得率高、增殖能力和分化能力强、免疫应答能力弱等特点[7-13]，因而在再生医学研究中受到了越来越多的关注。

目前国内外对人IPFP-ASCs 的研究还处于发展阶段，尽管人们对IPFP-ASCs 的体内外增殖能力、多项分化潜能、临床研究等方面均进行了一定的研究[14-15]，但目前脂肪间充质干细胞分离提纯率及成软骨分化能力均仍待进一步研究及提高。该实验通过对IPFP-ASCs 进行分离、培养、鉴定以及成软骨诱导分化，观察其生长特性，评价其成软骨分化能力，为IPFP-ASCs 在软骨组织工程中的进一步研究和应用提供实验依据。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2019 年12 月至2020 年6 月在广东省第二中医院(广东省中医药工程技术研究院)中药药理(毒理)研究室的分子生物学实验室和细胞培养室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂 高糖DMEM 培养基、0.25%胰蛋白酶、双抗、DPBS 和ITS-G(100×)(美国Gibco 公司)；胎牛血清(澳大利亚Bovogen公司)；Ⅰ型胶原酶、地塞米松、维生素C和脯氨酸(美国Sigma 公司)；重组人转化生长因子β3(美国Peprotech公 司)；CD44-PE-Cyanine7、CD45-FITC 抗 体( 美 国Tonbo Biosciences 公司)；CD105-PE 抗体(美国eBioscience 公司)；4%组织细胞固定液、Trigol 试剂(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；PrimeScript RT Master Mix、TB Green? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(大连宝生物工程有限公司)；Ⅱ型胶原抗体(美国Proteintech 公司)；甲苯胺蓝染液(南京建成科技有限公司)；苏木精染液(上海碧云天生物技术有限公司)；兔Streptavidin-HRP 试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；CCK-8 试剂盒(上海东仁化学科技有限公司)；TritonX-100(美国Sigma 公司)；相关基因引物(上海英潍捷基贸易有限公司)。

1.3.2 实验仪器 Cellometer Mini 自动细胞计数仪(美国Nexcelom 公司)；FC500 流式细胞仪(美国Beckman 公司)；Varioskan Flash 全波长多功能酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；3K30 冷冻高速离心机(德国Sigma 公司)；Class II Type B2 生物安全柜(新加坡Esco 公司)；3111CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；DMI8 倒置荧光显微镜(德国Leica 公司)；StepOnePlus 实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；40 μm 细胞过滤网(美国Biologix 公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 IPFP-ASCs 的获取 在广东省第二中医院骨科行全膝关节置换术中切取的8 例患者废弃的髌下脂肪垫用于分离培养IPFP-ASCs，患者年龄60-75 岁，无糖尿病、肝炎、痛风性关节炎及代谢性疾病。该研究获得了广东省第二中医院伦理委员会批准以及患者知情同意。

无菌条件下获取患者废弃的髌下脂肪垫，将其移入无菌操作台，首先用无菌眼科剪剪掉肉眼可见的红色血管以及白色结缔组织，然后将剩余脂肪组织剪成1.0-2.0 mm3碎块，DPBS 清洗2 次，每次5 min；然后用0.25%胰蛋白酶在37 ℃消化1 h；吸弃0.25%胰蛋白酶，加入用不含血清的高糖DMEM 培养基配制的0.2%Ⅰ型胶原酶溶液，消化过夜，第2天转移至50 mL 离心管内，小心吸取下层液体然后经过40 μm细胞过滤网过滤，再转移至15 mL 离心管，1 500 r/min 离心，沉淀用2 mL 基础培养基(高糖DMEM 培养基+体积分数为10%胎牛血清+1%双抗的溶液)溶解并且转入细胞培养瓶中，放入37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养，一两天后可见细胞贴壁生长，即为原代IPFP-ASCs。将得到的原代IPFP-ASCs 培养24 h 后进行半量换液，48 h 后进行全量换液，之后每2 d 换液1 次，培养5-7 d 后原代IPFP-ASCs 可生长融合达到90%以上，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1 ∶3 比例传代接种到新的细胞培养瓶中持续体外培养。

1.4.2 IPFP-ASCs 的形态观察 取第2 代长满培养瓶的IPFP-ASCs，用0.25%胰蛋白酶消化，1 500 r/min 离心10 min，用基础培养基重悬并调整细胞浓度约为5×107L-1，以每孔100 μL 接种于10 个96 孔板中即为第3 代IPFP-ASCs，将该细胞置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中连续培养10 d，在不同时间用光学显微镜观察并拍摄细胞形态和增殖状况。

文章来源：《文物鉴定与鉴赏》 网址: http://www.wwjdyjs.cn/qikandaodu/2021/0507/667.html

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