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人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化(2)
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摘要:1.4.3 CCK-8 检测IPFP-ASCs 的增殖活力 取第2 代长满培养瓶的IPFP-ASCs,用0.25%胰蛋白酶消化,1 500 r/min 离心10 min,用基础培养基重悬并调整细胞浓度约为5×107L-
1.4.3 CCK-8 检测IPFP-ASCs 的增殖活力 取第2 代长满培养瓶的IPFP-ASCs,用0.25%胰蛋白酶消化,1 500 r/min 离心10 min,用基础培养基重悬并调整细胞浓度约为5×107L-1,以每孔100 μL 接种于10 个96 孔板中即为第3 代IPFP-ASCs,将该细胞置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中连续培养10 d,从第2 天起,每天取1 个96 孔板,每孔加入CCK-8 溶液10 μL,相同条件下继续培养4 h,然后用多功能酶标仪检测450 nm 条件下各孔的吸光度值,以时间为横轴,吸光度值为纵轴绘制生长曲线。
1.4.4 流式细胞仪检测IPFP-ASCs 的表面抗原 取第3 代长满培养瓶的IPFP-ASCs,用0.25%胰蛋白酶消化,1 500 r/min 离心10 min 后,尽量弃去上清液,500 μL DPBS 溶解沉淀,再分别吸取100 μL 到5 个流式细胞仪专用管中,分别为阴性组、CD44组、CD45组、CD105组和CD44+CD45+CD105组,CD44、CD45、CD105 组 分 别 加 入1 μL 相 应 抗 体,CD44+CD45+CD105 组加入3 种抗体,每种抗体均为1 μL,阴性组不加任何抗体,充分混匀后室温避光静置25 min,然后每管加入4 mL 鞘液, 1 500 r/min 离心5 min 后小心轻轻倒掉上清液,用600 μL 鞘液溶解混匀底部的沉淀,避免生成气泡,放入流式细胞仪进行检测。
1.4.5 IPFP-ASCs 成软骨诱导分化 将第3 代IPFP-ASCs 计数后以1×104个/孔铺在装有细胞爬片的6 孔板中,分为2 组:空白对照组继续用基础培养基培养,诱导分化组在此培养基中加入10 μg/L 转化生长因子β3、100 nmol/L 地塞米松、1%ITS-G、50 mg/L 维生素C 以及40 mg/L 脯氨酸,所有细胞均为每2 d 换液1 次,连续培养第14 天收集细胞。
1.4.6 免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色 在成软骨诱导第14 天时,将两组细胞的细胞爬片取出后用4%组织细胞固定液将其固定15 min,DPBS 洗涤3 次,每次5 min;用0.1%TritonX-100 浸润15 min,DPBS 洗涤3 次,每次5 min;用内源性过氧化物酶封闭液室温孵育10 min,DPBS 充分淋洗;用羊血清工作液室温孵育10 min 后甩干;加入稀释好的Ⅱ型胶原蛋白一抗抗体(1 ∶1 000)在37 ℃孵育2 h,DPBS 充分淋洗;加入生物素标记羊抗兔二抗工作液,室温孵育10 min,DPBS 充分淋洗;加入HRP 标记的链霉亲和素,室温孵育10 min,DPBS 充分淋洗;最后用DAB 显色,显色后用苏木精复染1 min,通过水洗终止显色,将其用于免疫组织化学染色鉴定。另取细胞爬片,用4%组织细胞固定液将其固定15 min,DPBS 洗涤3 次,每次5 min,然后用甲苯胺蓝染液染色20 min,水洗后将其用于甲苯胺蓝染色鉴定。
1.4.7 总RNA 提取及RT-qPCR 检测 采用Trigol 试剂分别提取成软骨诱导第14 天空白对照组和诱导分化组细胞的总RNA,然后采用反转录获得相应的cDNA,反转录反应体积为10 μL, 包 括 总RNA 8 μL,5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL,反应条件:37 ℃、15 min,85 ℃、5 s。PCR 反应体积为25 μL:前、后引物和无菌水混合物11 μL,cDNA 1 μL,TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) (2×) 12.5 μL,ROX Reference Dye 0.5 μL,反应条件:94 ℃、5 min;94 ℃、30 s,58 ℃、30 s,72 ℃、50 s,45 个循环;72 ℃延伸5 min。用于PCR 检测的相关基因引物信息如表1 所示。
表1 |相关基因引物信息Table 1 |Primer information of related genes基因名称 基因序列号 引物序列(5'-3') 产物大小ACAN BC0 前引物:CAA CTA CCC GGC CAT CC 160 bp后引物:GAT GGC TCT GTA ATG GAA CAC BMP-2 NM_001200 前引物:GCA TCC TCT CCA CAA 129 bp后引物:GCC ACA ATC CAG TCA COL2A1 NM_001844 前引物:GTG TCA GGG CCA GGA TGT 116 bp后引物:TCC CAG TGT CAC AGA CAC AGA T SOX-9 NM_000346 前引物:ACC AGT ACC CGC ACT TGC AC 82 bp后引物:CGC TTC TCG CTC TCG TTC AG GAPDH M 前引物:CCC ATC ACC ATC TTC CAG GAG 105 bp后引物:CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC G
1.5 主要观察指标 IPFP-ASCs 的形态、增殖活力、特异性表面标记物;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和甲苯胺蓝染色对IPFP-ASCs 成软骨分化能力进行鉴定;RT-qPCR 检测成软骨诱导分化后相关基因的表达。
1.6 统计学分析 实验数据采用SPSS 22.0 软件进行分析,最终结果以±s表示。两组间的比较采用两独立样本t检验,P< 0.05 为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 IPFP-ASCs 的形态 将第3 代IPFP-ASCs 接种到培养板中,4 h 后显微镜下可见少量细胞开始贴壁生长,形态以圆形或椭圆形为主;第2 天已有较多细胞贴壁,并且呈长梭形或短梭形,见图1A;第3 天细胞数量略有增加,形态仍为长梭形或短梭形;随后进入对数生长期,在第5 天IPFP-ASCs 形态主要呈长梭形,细胞形态与成纤维细胞相似,并且大小均一,见图1B;在第8 天细胞基本铺满培养板底部,并且排列紧密,达到融合时呈螺旋状生长,见图1C。
文章来源:《文物鉴定与鉴赏》 网址: http://www.wwjdyjs.cn/qikandaodu/2021/0507/667.html