古籍《中庸大学》污染霉菌的鉴定及其纸质样品(3)

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摘要：在实验过程中，发现每本古籍的污染菌株以及程度均不同，针对此种现象，应该为古籍建立一个霉菌污染档案，用其记录古籍的污染菌株、污染程度，根据

在实验过程中，发现每本古籍的污染菌株以及程度均不同，针对此种现象，应该为古籍建立一个霉菌污染档案，用其记录古籍的污染菌株、污染程度，根据污染菌株的生活习性及其对古籍的危害，制定出有针对性的祛霉方案，例如根据繁殖速度的快慢决定多久需要进行一次检查，同时古籍保存条件应该避开所污染菌株的最适生长条件，增加抑菌物质等科学有效的防霉、祛霉措施，延长古籍的寿命，避免无法挽回的缺失[12].

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0 引言自人类发明了纸张，文明的发展、文化的传播便进入了崭新的历史阶段.中华文明源远流长博大精深，研究保护好传统文化是我们责无旁贷的责任，古籍正是这些传统文化遗产的重要载体，保护好、传承好、利用好古籍，对于发展文化自信、建设中国特色社会主义文化事业、铸就中华文化新辉煌具有重大意义[1].但是不能回避的问题是这些古籍的长久保存却受到各种因素的影响[2-3]，其中作为空气中数量众多的气传生物学微粒的霉菌孢子在空气中的数量可达到20万个/m3[4]，这些孢子以纸张为营养物质大量繁殖，对其造成变色、粘连、机械强度下降等损伤，严重者甚至可使其腐烂直至变成“档案砖”，造成不可挽回的损失.为此，从现代生物学角度出发，对辽宁大学图书馆馆藏古籍上霉菌进行科学采样、复苏、鉴定[5]，与此同时利用仿古宣纸为材料，设计方案将古籍上采得菌样复制模拟，进而使用生物酶清洗剂对模拟样品进行清洗，从中筛选最优方案，以期为古籍防霉治霉工作提供更加可靠方案.1 材料与方法1.1 材料、试剂模拟用纸：仿古宣纸；木瓜酶，Merck & Co Inc；葡萄糖，琼脂，抗坏血酸，巯基乙醇，国产分析纯；真菌试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司；核酸染料，宝生物工程有限公司；DNA Marker，宝生物工程有限公司；DDH2O，上海生工生物工程技术服务有限公司；上游引物为NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，下游引物为NS8：5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，以上均由上海生物工程有限公司合成[6-7].1.2 仪器与设备立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司；电热恒温培养箱 DNP-9082 型，上海跃进医疗器械有限公司；台式恒温振荡器，Blue Pard；高速冷冻离心机，科大创股份有限公司；DYY-2稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂；电泳槽，北京市六一仪器厂；凝胶成像系统，BIO-RAD；PCR仪，BIO-RAD；核酸蛋白测定系统，基因有限公司；1.3 方法1.3.1 培养基的配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂10g，水1 000 mL，121℃灭菌.马铃薯液体培养基(PDB)：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，121 ℃灭菌[6].1.3.2 文物霉菌的复苏及纯化在古籍特藏室取出古籍《中庸大学》，用灭过菌的棉签轻轻擦拭霉斑，并迅速将棉签放入盛有PDB的培养瓶中，28℃恒温培养箱培养.待菌落长出，进行多次划线纯化，得到纯化菌株.1.3.3 复苏霉菌的形态学鉴定用接种环蘸取少量之前纯化后的单菌落的孢子，接到PDA平板上，待其菌落长出，观察培养特征及显微镜观察形态特征.参考霉菌鉴定资料，根据菌株的菌落形态、生长速率、质地、大小、颜色、培养基背面颜色变化、菌丝体和孢子的形态等特征对上述复苏、分离、纯化的菌株进行鉴定[7-9].1.3.4 复苏霉菌的分子生物学鉴定用试剂盒提取菌株DNA，以其为模板，NS1和NS8为引物进行PCR扩增，反应体系为50μL，具体添加量为Taq PCR Master Mix：25 μL，DNA template：1μL，引物1∶2μL，引物2∶2μL，补无菌水到50μL.PCR产物进行电泳检测并测序；以霉菌18S rDNA-ITS序列，选取其中相似度较高的几株，利用MEGA7.0软件，采用N-J法(重复度1 000)构建系统发育树[10].1.3.5 纸质文物霉斑样品的制备在无菌条件下，将霉菌的孢子悬液喷洒在灭菌后的宣纸上，放入恒温培养箱中培养，待纸质上形成较好的菌斑后，放入密封的干燥盒中备用.1.3.6 复配清洗剂祛霉性能的优化本实验室前期利用不同的生物酶作为主要的清洗剂成分对霉斑进行祛除，已经确定木瓜蛋白酶对纸质的清洗效果较好，基本达到了古籍的清洗标准，但是基于古籍的珍贵程度，加入抗坏血酸对木瓜酶清洗剂祛霉性能进行改良[11]，期望得到最佳的清洗效果.1.3.7 清洗方法将前期准备好的霉斑纸样从中间剪开分为清洗组与对照组，将清洗组固定在两块玻片之间，置于装有生物酶复配清洗剂的容器中，用其将霉斑纸样浸润30 min，接着用下述虹吸装置祛除掉残余的清洗剂，待其自然干燥，存放于室温、相对湿度为35%的环境中16 h后进行性能检测，见图1.图1 清洗装置图2 实验结果2.1 菌落复苏结果在古籍《中庸大学》中间页天头处检测到菌株，并成功复苏.见图2.图2 古籍检测位置2.2 菌落特征及结果菌落特征：菌落呈广铺的棉絮状，起初为白色致密的平坦菌丝，而后边缘出现浅绿的产孢子丛束区，反面无色.图3 菌落形态图和显微结构图镜检特征：分生孢子梗菌丝的短侧枝，多分枝；小梗瓶形，中部弯曲；分生孢子椭圆形或长形，单细胞，无色，壁光滑，成堆时绿色.见图3.2.3 18S rDNA扩增测序结果取菌株的总DNA为模板，以序列NTS1、NTS8为引物，进行PCR扩增.从测序结果可看出菌株的18SrDNA片段长度均在1800 bp左右.测序结果如下：GGTTCGCTGTCTAGTATAGCATTATACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAATACTTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTGAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCTCTGGTGAATCATAATAACTAGTCGAATCGACAGGCCTTGTGCCGGCGATGGCTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTGGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATCGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGCGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGCTCAAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGATGTTACATTTTTGACGCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCCGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACAGAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGCCGGAAGGCCTGGGTAATCTTGTTAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGAGAGGTGGGCAAC 分子进化树的构建上述序列构建菌株系统发育树见图4.根据系统发育树结果，表明菌株与(Accession number)CP0同源性99%，系统发育树结合形态特征，显微镜观察，可确定该菌株为里氏木霉(Trichodermareesei).注：前边为GenBank登录号；分支点上的数字为自展值百分比；线段0.005 为核苷酸替换率.图4 菌株系统发育树图2.5 纸质文物霉斑模拟样品制备图无菌条件下，在宣纸上喷洒霉菌液制备出的霉斑样品模拟图，见图5.图5 霉斑模拟样品图2.6 复配清洗剂与加入抗坏血酸后的复配清洗剂清洗宏观对比图用水、主要成分为木瓜酶的复配清洗剂、加入抗坏血酸的复配清洗剂分别清洗霉斑纸质样品，其中复配清洗剂中木瓜酶浓度为3%，加入抗坏血酸的复配清洗剂中木瓜酶浓度为3%、抗坏血酸浓度为0.06%，清洗条件均为温度为30.7℃、pH为6.0.清洗前后数码图见图6.注：ABC分别为霉斑纸样清洗前的图片abc分别为用水、木瓜酶复配清洗剂、加入抗坏血酸的复配清洗剂清洗后的数码图片图6 三种溶液对霉斑样品清洗前后数码图3 结论与讨论纤维素作为纸张的主要成分，使纸张极易受霉菌的污染，进而形成各种霉斑，因此祛除霉斑是目前古籍修复保护工作的重要任务之一.目前祛霉手段多为化学药品，这有可能对古籍造成二次损害，同时也会出现无法针对性地解决不同霉斑的情况，所以选择专一性、高效性的清洗剂是古籍保护工作的新要求新趋势.考虑到古籍的珍贵与稀缺性，无法直接用于进行实验，我们设计了对古籍上的霉斑进行复苏，而后利用仿古宣纸复制菌斑这一思路，既对古籍的霉菌污染情况进行了分析又解决了无法直接在古籍上进行实验的矛盾.我们通过复苏古籍《中庸大学》的菌株，经分离纯化鉴定为里氏木霉.前期实验室经过筛选已经确定木瓜酶对纸质霉斑有清洗效果，为了更好地祛除霉斑，在生物酶清洗剂中添加抗坏血酸保护酶活性基团，经过比较最终确定利用3%木瓜酶浓度、0.06%抗坏血酸浓度、pH6.0的复配清洗剂在温度为30.7℃对霉斑样品进行清洗的效果良好，此数据为古籍保护过程中霉斑的祛除提供了科学数据.在实验过程中，发现每本古籍的污染菌株以及程度均不同，针对此种现象，应该为古籍建立一个霉菌污染档案，用其记录古籍的污染菌株、污染程度，根据污染菌株的生活习性及其对古籍的危害，制定出有针对性的祛霉方案，例如根据繁殖速度的快慢决定多久需要进行一次检查，同时古籍保存条件应该避开所污染菌株的最适生长条件，增加抑菌物质等科学有效的防霉、祛霉措施，延长古籍的寿命，避免无法挽回的缺失[12].参考文献：[1] 周崇润，李景仁. 谈谈图书馆纸质文献的酸化与脱酸[J]. 图书馆界，2004(4)：55-56.[2] 曹宇. 碳化、脆化文献脱酸加固问题研究[J]. 图书馆建设，2016(5).[3] 邢来君，李明春．普通真菌学[M]．北京：高等教育出版社，1999：193．[4] 李蔓. 对纸质文物霉菌危害的防治[J]. 中国文物科学研究，2011(4)：34-37.[5] 唐欢，王春，范文奇．馆藏纸质书画文物上霉菌的分离及鉴定[J]．文物保护与考古科学，2015，27(2)：40-41.[6] 李其久，段大程，刘辰澍，等.晚清书画裱件一株霉菌的鉴定及培养条件优化[J].辽宁大学学报(自然科学版)，2018，45(1)：59-63.[7] Molina W F，Jr P M G. Multiple pericentric inversions and chromosomal divergence in the reef fishes Stegastes(Perciformes，Pomacentridae)[J]. Genetics & Molecular Biology，2004，27(4)：543-548.[8] 周德庆.微生物实验教程[M].北京：高等教育出版社，2005：58-61.[9] 何璐，肖淑琴，关鑫，等.1株孜然内生菌的分离鉴定及代谢产物的GC分析[J]. 沈阳农业大学学报，2018，49(6)：730-734.[10] Paulino P G，Pires M S，Silva C B D，et al. Comparison of heat shock protein 70 kDa，and 18S rDNA，genes for molecular detection and phylogenetic analysis of Babesiavogeli，from whole blood of naturally infected dogs[J]. Ticks and Tick-borne Diseases，2018，9(3)：556-562.[11] 张存滢. 重金属对木瓜蛋白酶的离子效应及作用机理[D]. 湘潭：湘潭大学，2013.[12] 孙超，梅琳，贲松彬.古籍霉菌污染治理举措刍议[J].兰台世界，2018(09)：63-65.

文章来源：《文物鉴定与鉴赏》 网址: http://www.wwjdyjs.cn/qikandaodu/2020/1026/472.html

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