馆藏清代牧牛图轴的微生物病害研究(2)

作者:网站采编
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摘要：1.2.4微生物的形态观察 采用解剖针刮取少量纯化菌株于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜(OM)下观察形态特征并拍照保存。 1.2.5基因组DNA的提取 细菌总

1.2.4微生物的形态观察 采用解剖针刮取少量纯化菌株于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜(OM)下观察形态特征并拍照保存。

1.2.5基因组DNA的提取 细菌总DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(BacteriaGen DNA Kit)。真菌总DNA的提取方法如下：取适量纯培养物置于100 μL微生物裂解试剂盒(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)中，于80 ℃中水浴20 min，直接作为DNA模板用于后续PCR。

1.2.6PCR扩增[11]细菌扩增的引物序列为24F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应体系为50 μL，其中24F、1492R各1 μL，Taq酶0.5 μL，10×PCR缓冲液5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4 μL，MgCl24 μL，DNA模板1.5 μL，无菌双蒸水33 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸100 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。真菌ITS基因片段扩增的引物序列为ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反应体系为50 μL，其中ITS1、ITS4各1 μL，Taq酶0.4 μL，10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，DNA模板2 μL，无菌双蒸水33.6 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增完毕，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度。

1.2.7序列比对 待测细菌的16S rDNA和真菌的内源转录间隔区(internally transcribed spacer，ITS)序列经过DNAMAN 6.0软件校正后，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)中进行同源性序列搜索(BLAST search)。

1.2.8酶活测定 由于微生物具有不同的酶学系统，致使它们可以利用不同或者相同的底物产生不同的代谢产物。微生物的活性和生长繁殖与细胞外分泌的酶相关。研究各种胞外酶活性及作用是研究微生物致病机理的一个重要方面。为评估《牧牛图》轴上分离得到微生物的代谢和破坏能力，采用法国API-ZYM半定量微量方法系统测定了微生物19种胞外酶——碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶的活性。该试剂盒专为研究酶活性所设计，包括4种酯酶、5种蛋白酶、2种水解酶和8种糖发酵酶。

1.2.9模拟样品的制备 挑取纯化菌株孢子，将孢子分散于马铃薯葡萄糖液体培养基中，放入恒温培养震荡器中，28 ℃，125 r/min过夜培养制成孢子菌悬浮液。然后用喷雾器将稀释后的孢子悬液喷洒到宣纸纸样表面，放入培养箱中，保持湿度为80%、温度28 ℃。

2 结果与分析

2.1 书画本体分析检测结果

样本的pH值在3.72～5.06范围，酸度值偏高；样本的含水率为12%，远远超出了纸张正常含水率水平；污斑样本在扫描电子显微镜下放大500倍，可见表面布满菌丝，如图2a所示。纸张本体含水率过高会导致微生物的孳生，微生物代谢产生的有机酸又会增加载体的酸度，这些因素造成书画本体腐蚀、破碎，如图2b所示。

图2《牧牛图》样本扫描电子显微图Fig.2SEM images ofMuNiuTu

据研究报告[12]，微生物代谢中产生的有机酸主要有柠檬酸(青霉)、葡萄糖酸(青霉和曲霉)、甲酸、乳酸、延胡羧酸、丙酸、五倍子酸、丁烯二酸(根霉)等十几种酸。这些有机酸同无机酸一样可明显加大纸张酸性，使纸张变黄发脆，强度降低，是影响纸张寿命的主要因素。

2.2 分离纯化结果

书画文物Sample 1和Sample 2处共获得7株细菌和6株真菌，用接种针挑取少量已纯化菌株于载玻片上，于显微镜下观察、拍照，其中，F1-1～F1-3为Sample 1处分离纯化得到的真菌(图3a～3c)，F2-1～F2-3为Sample 2处分离纯化得到的真菌(图3d～3f)。

2.3 鉴定结果

利用BLAST检索对测序结果进行序列比对，结果表明：提交的13个序列分属于4个细菌属和5个真菌属，具体结果见表1和表2。7株细菌属于4个属：芽孢杆菌属(B1-1、B1-2、B2-2)、微球菌属(B1-3、B2-3)、假单胞菌属(B1-4)和葡萄球菌属(B2-1)。6株真菌属于5个属：根霉属(F1-1)、耙齿菌属(F1-2)、裂褶菌属(F1-3、F2-3)、蜡质菌属(F2-1)和腐霉菌属(F2-2)。

单菌落培养发现：F1-1菌株(Rhizopusoryzae)在培养后期会产生黑色颗粒，而Sample 1为黑色污斑样品，故F1-1(Rhizopusoryzae)可能与黑色污斑上的污染物相关。而据文献报道[13]，根霉属为纸张常见的霉变种属。同时，F2-3菌株(Schizophyllumcommune)在培养后期会产生红色色素，这也可能会导致样品表面产生红色污渍。为了验证这种推测，本研究通过模拟实验(详见1.2.9部分)，挑取F1-1菌株孢子作为受试菌，将其分散于马铃薯葡萄糖液体培养基中，并将制成的孢子菌悬浮液喷洒到宣纸纸样上。通过一段时间的培养，模拟纸样上遍布了黑色的斑点。从而，这也证实了推测的可能性，后续将采用质谱等检测手段做进一步研究。

文章来源：《文物鉴定与鉴赏》 网址: http://www.wwjdyjs.cn/qikandaodu/2021/0708/724.html

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