兔主动脉内皮细胞的分离培养及生物学特性(2)

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摘要：1.4.3 内皮细胞的传代培养 待单层细胞长满约80%后，向每孔加入0.25%胰蛋白酶消化液0.5 mL，显微镜下观察，待细胞收缩变圆后，加入1.5 mL 培养基轻轻吹打，

1.4.3 内皮细胞的传代培养 待单层细胞长满约80%后，向每孔加入0.25%胰蛋白酶消化液0.5 mL，显微镜下观察，待细胞收缩变圆后，加入1.5 mL 培养基轻轻吹打，移入15 mL的离心管中，以1 000 r/min×6 min 离心，弃上清，用M199培养基(含体积分数20%胎牛血清、2%青链霉素)混匀沉淀细胞，使细胞充分悬浮，血球计数板计数，按5×104个/瓶移入T-25 培养瓶中继续培养。

1.4.4 细胞增殖检测 选择第2 代内皮细胞，接种浓度为(1-3)×104cm-2，平均接种于24 孔板内。第1-7 天每隔24 h取3 孔细胞，弃培基，消化后于倒置显微镜下用血细胞计数板计数细胞，取其平均值，以对数表示于半对数坐标纸上，绘制主动脉内皮细胞生长曲线。

1.4.5 内皮细胞形态学观察 培养过程中在倒置显微镜下观察活细胞的形态特点、经吉姆萨染色(步骤见细胞成活率测定)并摄片，观察所培养细胞是否为内皮细胞。

1.4.6 CD34 免疫细胞化学染色 CD34 属于A 型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，是一种相对分子质量为110 000 的单链跨膜蛋白，主要表达于造血干细胞、急性白血病细胞和血管内皮细胞[11]，因此CD34 可做为血管内皮细胞的特异性标记物之一。

此次实验向35 mm 皿中植入2 mL 含有1×106细胞的细胞悬液，待细胞贴壁后，0.01 mol/L PBS 轻轻漂洗3 次，每次约2 min；加无水乙醇于4 ℃冰箱固定约2 h，弃无水乙醇；加PBS(盖过皿底)，于4 ℃冰箱约2 h，弃PBS；0.01 mol/L PBS轻轻漂洗3 次，每次2 min，滴加一抗，放入湿盒内4 ℃过夜，同时另一皿内不加一抗作为阴性对照组。次日，用PBS 冲洗3 次，每次2 min，滴加辣根酶标记的IgG，37 ℃培养箱中孵育约45 min，0.01 mol/L PBS 轻轻漂洗3 次，每次约2 min；滴加DAB 显色液显色，显微镜下观察，待出现特异性染色后，终止显色，以细胞膜出现棕褐色沉淀判定为阳性结果，相差显微镜下观察并摄片，以确定其是否为主动脉内皮细胞并进行纯度分析。

1.4.7 细胞纯度分析 将经CD34 免疫细胞化学染色后的主动脉内皮细胞，于倒置相差显微镜(×400)下随机选5 个视野进行细胞计数，计算细胞的阳性表达率，细胞阳性表达率=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5 主要观察指标 ①酶消化法分离、培养兔主动脉内皮细胞结果；②吉姆萨染色法观察主动脉内皮细胞的形态特点；③CD34 免疫细胞化学染色鉴定结果；④细胞计数法绘制主动脉内皮细胞生长曲线。

2 结果 Results

2.1 倒置相差显微镜观察细胞培养结果 倒置显微镜下可见呈扁平梭形[12]、多角形、镶嵌形排列的内皮细胞贴壁生长，随细胞数目增加而形成单层铺路石样排列(图1)。经吉姆萨染色后镜下观察，细胞呈扁平的多角形，边界清楚，胞浆丰富着淡蓝色，核多呈卵圆形居中，核仁较明显有2-4 枚(图2)。免疫组化染色：内皮细胞经CD34 免疫细胞化学染色后内皮细胞呈强阳性反应，细胞膜出现棕褐色着色，胞质内显示棕褐色颗粒(图3)，证实所培养细胞为内皮细胞。

2.2 细胞成活率测定 按计数板的四角大方格(每个大方格又分16 个小方格)内的细胞数计数。计数时，只计数完整的血管内皮细胞，若细胞聚成一团则按一个细胞进行计数；在一个大方格中，若有细胞位于线上，一般计下线、左线细胞，不计上线、右线细胞；二次重复计数误差不超过±4%。镜下观察，凡折光性情强而不着色者为拒染的活细胞，染上蓝色者为死细胞，按细胞悬液细胞数/mL=4 个大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数的计算方式，经计算得其存活率为＞90%。

2.3 CD34 免疫细胞化学染色鉴定结果 CD34 免疫组化染色结果显示，内皮细胞膜出现棕褐色着色，细胞内含有褐色颗粒，表明分化后的细胞表达CD34(图3)。

2.4 内皮细胞生长曲线 兔主动脉内皮细胞的传代细胞增殖速度明显增快，生长曲线为“S”形，在细胞培养的第1 天细胞开始生长，但速度较慢；第2-4 天生长加快，进入对数生长期；第5 天后内皮细胞增殖缓慢，细胞进入平台期，细胞倍增时间为第2 天(图4) 。

2.5 细胞纯度分析 将CD34 免疫细胞化学染色后的主动脉内皮细胞置于400 倍显微镜下，随机选5 个视野进行细胞计数，所见细胞均为阳性染色细胞，阳性表达率约大于95%，提示联合应用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶(按1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶4 混合)的消化液消化后分离、培养主动脉内皮细胞，可获取的内皮细胞纯度约大于95%。

3 讨论 Discussion

自JAFFE 等[13]在1973 年成功进行脐静脉内皮细胞培养以来，国内外对内皮细胞的生物学特性进行了大量的研究，如选择性屏障、血管活性物质代谢、止血、抗凝与纤溶系统的功能等。又因为内皮细胞具有异质性，不同动物，不同组织、器官，不同血管的内皮细胞，在结构、功能、抗原成分、代谢特性、对生长因子的反应等方面皆有不同，甚至在同一微循环单位内不同节段的内皮细胞也会表现出明显的差异性。因此，建立不同动物、不同组织器官的内皮细胞体外培养体系是十分必要的。有研究表明，组织块移植和机械刮取法是获取主动脉内皮细胞的常用方法[8-9]，但这两种方法均易混杂平滑肌细胞或其他血管壁细胞，从分离细胞数量、保持细胞活性来看，采用酶消化法能比较容易地获得高纯度兔原代主动脉内皮细胞[14]。此次实验采用联合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶(按1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶4 混合)消化的方法获取原代兔主动脉内皮细胞，通过对其进行体外培养、传代、鉴定，观察到如下几点体外培养的生物学特征：①体外培养兔主动脉内皮细胞的生长呈典型的“铺路石”样生长；②CD34 免疫组化染色后，内皮细胞膜出现棕褐色着色，细胞内含有褐色颗粒，表明分化后的细胞可以表达CD34；③主动脉内皮细胞容易贴壁，但由于内皮细胞长成单层铺满后存在接触性抑制，细胞数量不再增殖，故MTT 法进行增殖测定时，生长曲线为“S”形，内皮细胞的数量在第5 天进入平台期；④冻存复苏后的内皮细胞仍然保持活力，增殖旺盛，说明内皮细胞对恶劣环境的耐受力比较强。

文章来源：《文物鉴定与鉴赏》 网址: http://www.wwjdyjs.cn/qikandaodu/2021/0728/738.html

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