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兔主动脉内皮细胞的分离培养及生物学特性(3)
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摘要：图1 ｜正常2 代内皮细胞培养结果(倒置相差显微镜，×50)Figure 1 ｜Culture of normal second generation of endothelial cells (inverted phase contrast microscope, ×50)图注：图A-D 分
图1 ｜正常2 代内皮细胞培养结果(倒置相差显微镜，×50)Figure 1 ｜Culture of normal second generation of endothelial cells (inverted phase contrast microscope, ×50)图注：图A-D 分别为第1，3，5，7 天的培养结果
图2 ｜正常内皮细胞吉姆萨染色(倒置相差显微镜，×400)Figure 2 ｜GIEMSA staining in culture of normal endothelial cells (inverted phase contrast microscope, ×400)
图3 ｜CD34 免疫细胞化学染色(倒置相差显微镜，×200)Figure 3 ｜Immunohistochemical staining for CD34 (inverted phase contrast microscope, ×200)
图4 ｜内皮细胞生长曲线Figure 4 ｜Growth curve of endothelial cells图注：在细胞培养的第1 天细胞开始生长，但速度较慢；第2-4 天生长加快，进入对数生长期；第5 天后内皮细胞增殖缓慢，进入平台期
随着主动脉内皮细胞分离、培养方法的不断改进，此次及研究有如下几点心得体会：①在消化过程中，消化时间决定了分离细胞的活力和纯度。消化法分离细胞时，时间过短，则细胞量太少；消化时间过长，则细胞受损程度高、状态及活力不佳，且细胞纯度降低，故此次实验的消化时间约10 min，且联合应用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原酶、0.25%胰蛋白 酶(按1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶4 混 合)，既弥补了单一酶消化细胞力量不足，降低了胰蛋白酶对细胞的损伤，同时又保证了细胞的纯度。②消化后用无菌不锈钢镊子刮内膜时，用力一定要轻，使镊子对内膜层有接触感即可，或可轻轻撕下一层薄膜即兔主动脉血管内膜。③在内皮细胞的鉴定方面，由于CD34 鉴定内皮细胞可重复性较好，故除了形态学观察外，常进行CD34 免疫细胞化学染色鉴定；为使兔主动脉内皮细胞更好地应用于实验，还进行了细胞纯度分析，发现兔主动脉内皮细胞表现出接触性抑制的“铺路石”样特征，其标记物CD34 表达阳性，未发现平滑肌细胞或其他细胞等，提示此次实验获得了数量可观的高纯度血管内皮细胞。④有研究表明，在原代和传代培养条件中，添加内皮细胞生长因子，即可以促进内皮细胞的生长，又可以抑制周细胞及成纤维细胞等混杂细胞生长[15]，如内皮细胞生长补充物、表皮生长因子、内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子等；但由于血管内皮细胞生长因子可通过细胞间相互接触，以自分泌/旁分泌的形式发挥作用[16]，故此次实验未额外添加内皮细胞生长因子，而是采用单孔面积较小的24 孔板培养原代细胞，增加细胞间的接触，促使其积极的分泌生长因子，达到促进内皮细胞生长的目的。
结论：此次实验联合应用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶(按1∶1∶1∶1∶4混合)的消化液消化，其培养、传代、鉴定方法简捷经济，成功率高，重复性强，能获得大量高纯度的内皮细胞，以期为内皮细胞相关疾病的实验研究提供较为理想的研究材料和技术支持。
致谢：此次实验在导师张军平教授的严格要求和悉心指导下完成，在此向导师表示衷心感谢。感谢天津中医药大学国家中医药管理局病理三级实验室的范英昌教授，在课题实施过程中提供了多方的帮助和指导，保证了实验的顺利完成。感谢彭立、丁义、李光辉同学协作共事，同时也感谢研究生处各位老师在学习生活中给予的帮助。
作者贡献：张军平负责统筹管理，曹阳、彭立负责实验设计，曹阳、丁义、李光辉负责实验实施。
经费支持：该文章没有接受任何经费支持。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程，不存在利益冲突。
机构伦理问题：实验方案经天津中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。
文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。
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文章来源：《文物鉴定与鉴赏》 网址: http://www.wwjdyjs.cn/qikandaodu/2021/0728/738.html