人髌下脂肪垫干细胞的鉴定及成软骨分化(3)

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摘要：2.2 IPFP-ASCs 的增殖活力 根据CCK-8 法连续10 d 的检测结果绘制生长曲线，第3 代IPFP-ASCs 生长曲线呈“S”形，细胞潜伏期约为3 d，第4 天进入对数生长期，第

2.2 IPFP-ASCs 的增殖活力 根据CCK-8 法连续10 d 的检测结果绘制生长曲线，第3 代IPFP-ASCs 生长曲线呈“S”形，细胞潜伏期约为3 d，第4 天进入对数生长期，第8 天达生长高峰，此后进入平台期，生长速度明显减慢，见图2。

图1 ｜人髌下脂肪垫干细胞的形态(×50)Figure 1 ｜Morphology of infrapatellar fat pad derived stem cells (×50)图注：图中A 为第3 代细胞培养2 d，有较多细胞贴壁，呈长梭形或短梭形；B 为第3 代细胞培养5 d，呈长梭形，细胞形态与成纤维细胞相似，大小均一；C 为第3 代细胞培养8 d，细胞基本铺满培养板底部，并且排列紧密，达到融合时呈螺旋状生长

图2 ｜人髌下脂肪垫干细胞的生长曲线Figure 2 ｜Growth curve of human infrapatellar fat pad derived stem cells图注：第3 代细胞生长曲线呈“S”形，细胞潜伏期约为3 d，第4 天进入对数生长期，第8 天达生长高峰，此后进入平台期，生长速度明显减慢

2.3 IPFP-ASCs 的表面抗原 取第3 代 IPFP-ASCs，通过流式细胞术鉴定细胞表面特异性标记物CD44、CD45 和CD105，结果显示细胞群中CD44 和CD105 均为高表达，且阳性表达率均高于95%，而CD45 呈阴性表达，且阴性表达率小于2%，见图3。

2.4 IPFP-ASCs 成软骨诱导分化后相关染色鉴定结果 在诱导分化14 d 时，免疫组化染色显示诱导分化组细胞胞浆和细胞间质内出现棕黄色颗粒，表明诱导后细胞的Ⅱ型胶原免疫组化结果为阳性，见图4A；在诱导分化14 d 时，甲苯胺蓝染色显示诱导分化组细胞呈现蓝紫色，表明诱导后细胞的甲苯胺蓝染色结果为阳性，见图4B。

2.5 IPFP-ASCs 成软骨诱导分化后相关基因表达 如图5 所示，在诱导分化14 d 时，与空白对照组相比，诱导分化组IPFP-ASCs 的ACAN、BMP-2、COL2A1 和SOX-9 mRNA 表 达 明显升高(P＜ 0.05 或P＜ 0.01)。

图3 ｜人髌下脂肪垫干细胞的流式分析Figure 3 ｜Flow cytometry analysis of human infrapatellar fat pad derived stem cells图注：图中A 为CD44 和CD45 的表达；B 为CD105 和CD45 的表达；C为CD105 和CD44 的表达

图4 ｜人髌下脂肪垫干细胞成软骨诱导分化后相关染色鉴定结果(×100)Figure 4 ｜Staining results of human infrapatellar fat pad derived stemcells after induced differentiation (×100)图注：图中A 为Ⅱ型胶原免疫组化染色，细胞胞浆和细胞间质内出现棕黄色颗粒，染色结果为阳性；B为甲苯胺蓝染色，细胞呈现蓝紫色，染色结果为阳性

图5 ｜人髌下脂肪垫干细胞成软骨诱导分化后的相关基因相对表达量Figure 5 ｜Relative gene expressions of human infrapatellar fat pad derived stem cells after induced differentiation图注：与空白对照组比较，aP＜ 0.05，bP＜ 0.01

3 讨论 Discussion

髌下脂肪垫是充填于髌骨、股骨髁下部、胫骨髁前上缘及髌韧带之间，位于滑膜外关节内的一种以弹性纤维为网状支架的淡黄色脂肪组织[16]。DRAGOO 等[7，17]研究发现IPFP-ASCs 能够在体外分化成软骨和成骨表型，具有促进软骨和骨缺损修复的潜能，并且IPFP-ASCs 体内外增殖能力和成软骨分化能力强[7-13]。该研究对膝关节置换手术所得的IPFP-ASCs 进行了研究。

虽然对IPFP-ASCs 的研究逐渐成熟，但目前尚无分离IPFP-ASCs 的标准方法。髌下脂肪垫不同于皮下的液态脂肪组织，属于固态脂肪。在IPFP 取材后，首先需要仔细去除其他组织，特别是血管和结缔组织，再将剩余脂肪组织充分剪碎，用DPBS 反复浸泡和冲洗脂肪组织碎块。另外，该研究通过比较发现，在37 ℃下，0.25%胰蛋白酶的消化能力比0.2%Ⅰ型胶原酶的消化能力强，但胰蛋白酶作用时间过长会严重损伤细胞结构，进而导致其活性下降，无法正常贴壁；如果只用Ⅰ型胶原酶消化，耗时很长且细胞得率偏低，所以该研究综合运用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶来对IPFP 进行消化，先用胰蛋白酶消化1 h，然后再用Ⅰ型胶原酶消化过夜。值得一提的是，作者摸索的这种综合运用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶处理的方法适用于实验室无相关恒温振荡仪器，只能静置消化的情况。采用该方法处理一两天后可见原代IPFP-ASCs 开始贴壁生长，这时吸弃培养上清液，更换为新的基础培养基，通过差速贴壁方法可以极大程度地去除红细胞等不贴壁细胞；通过实验可看出，这种综合运用胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化法及差速贴壁法的分离培养方法极大提高了IPFP-ASC 的分离提纯率。该研究中采用CCK-8 法检测IPFP-ASCs 的增殖活力，CCK-8 法与传统的MTT 法相比灵敏度更高、数据更可靠，且操作更简便，对细胞的毒性低。从IPFP-ASCs 生长曲线图可以看出，第3 代IPFP-ASCs 具有较强的增殖能力，进入对数生长期后，细胞形态比较单一，均为长梭形。

文章来源：《文物鉴定与鉴赏》 网址: http://www.wwjdyjs.cn/qikandaodu/2021/0507/667.html

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